雙光徑濁度儀在疫苗細(xì)菌濃度檢測(cè)上的應(yīng)用

來源：http://m.ssygc.com/ 作者：余氯檢測(cè)儀 時(shí)間：2020-12-27

　　1977年美國(guó)許可了14價(jià)肺炎球菌多糖疫苗和4價(jià)流腦疫苗后，這些莢膜多糖的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)均為依靠物化和血清學(xué)的分析方法分析大量粉劑。隨后又發(fā)展了一種免疫電泳的方法用來測(cè)定肺炎成品疫苗中的多糖含量。微生物實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌濁度儀

　　經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)速率比濁儀(LSR nephelomety)除了被用于分析抗原抗體之間的動(dòng)態(tài)反應(yīng)來檢測(cè)蛋白濃度外，還可用來定量測(cè)定多糖。

　　在23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗成品質(zhì)控項(xiàng)目中，23型肺炎球菌多糖定量是疫苗的重要檢測(cè)項(xiàng)目之一。速率散射濁度法(LSR)則是測(cè)定各型肺炎多糖含量的主要方法。因?yàn)槔昧丝乖贵w的特異性反應(yīng)，所以可以準(zhǔn)確地檢測(cè)23價(jià)肺炎多糖疫苗中各型多糖的含量。不同于普通化學(xué)檢測(cè)方法無法準(zhǔn)確區(qū)分各型肺炎球菌多糖，該方法更為精確，并有較高的靈敏度。豐臨科技的雙光徑免疫濁度分析儀的工作原理就是基于速率散射濁度法。為此，我們對(duì)用IMMAGE測(cè)定8型肺炎球菌莢膜多糖進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)估，并討論其檢測(cè)實(shí)用性。

　　1材料與方法

　　1. 1肺炎球菌多糖

　　8、19F、5、17F、33F、10A六個(gè)型別的肺炎球菌精制多糖。1.2血清

　　8型肺炎血清來源于丹麥國(guó)立血清研究所。

　　1.3相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品

　　各項(xiàng)生化檢測(cè)指標(biāo)均合格的肺炎精制多糖，經(jīng)凍干衡重，精確標(biāo)定后，保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4儀器

　　貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的雙光徑免疫濁度分析儀(IMMAGE)，UDR試劑盒以及配套的緩沖液buffer 1、稀釋液dilution 1，由貝克曼庫爾特公司提供。

　　1.5方法

　　先將相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品放入IMMAGE的樣品盤中，將血清倒入試劑盒放入試劑盤中，進(jìn)入IMMAGE的用戶自定義試劑(UDR)系統(tǒng)，使用自建的用戶自定義檢測(cè)項(xiàng)目，進(jìn)行定標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將檢測(cè)樣品放入樣品盤中，用自定義檢測(cè)項(xiàng)目測(cè)定樣品。儀器可通過多點(diǎn)定標(biāo)曲線自動(dòng)計(jì)算樣本中的多糖含量。

　　1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用Microsoft Excel 2003和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理檢測(cè)數(shù)據(jù)。測(cè)定結(jié)果以x±s表示，兩樣本均數(shù)用t檢驗(yàn)。

　　2結(jié)果

　　2.1重復(fù)性測(cè)定

　　用8型肺炎球菌血清分別測(cè)定標(biāo)示量分別為2.0、1.5、1.0的A、B、C3個(gè)8型肺炎多糖樣品各10次，結(jié)果見表1。

　　2.2回收率測(cè)定

　　用8型肺炎球菌血清重復(fù)測(cè)定8型肺炎多糖樣品10次,回收率為(99.25±0.02)%(表2)。

　　2.3靈敏度

　　用零濃度的空白液連續(xù)檢測(cè)10次。測(cè)定結(jié)果為(0.120±0.016)μg/mL,計(jì)算分析靈敏度為0.2 μg/mL(表3)。

　　2.4稀釋實(shí)驗(yàn)

　　將樣品分別稀釋15、20、30、40倍，重復(fù)檢測(cè)3次，回收率為96.40% ～ 104.35%，平均值為99.82% ?；貧w方程為:Y=28.759X + 0.0369，r = 0.998(表4)。

　　2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性

　　用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品配制3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)物，將標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)物作為樣品檢測(cè)，每天測(cè)定1次，每次雙份測(cè)定，連續(xù)5 d。經(jīng)t檢驗(yàn)，校準(zhǔn)物的測(cè)定結(jié)果與定值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，標(biāo)準(zhǔn)曲線至少可穩(wěn)定5 d。

　　2.6干擾實(shí)驗(yàn)

　　采用配對(duì)差異試驗(yàn)法，建立8型肺炎球菌多糖樣品對(duì)照組和加入3個(gè)濃度的干擾物的試驗(yàn)組，每組樣品同時(shí)測(cè)定3次。計(jì)算干擾百分率(P)。干擾物為8、19F、5、17F、33F、10A六個(gè)血清型的肺炎球菌多糖。檢測(cè)結(jié)果干擾百分率(P)為1.35%～2.37%，配對(duì)t檢驗(yàn)分析加入干擾物前后的肺炎8型多糖測(cè)定結(jié)果表明，8型肺炎球菌多糖樣品中加入8、19F、5、17F、33F、10A六個(gè)型別的肺炎多糖及濃度對(duì)IMMAGE測(cè)定8型肺炎球菌多糖無明顯干擾(P>0.05)。

　　3討論

　　23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗含有1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F共23個(gè)血清型的肺炎球菌多糖。疫苗中各型肺炎多糖含量是一個(gè)重要的質(zhì)量指標(biāo)。目前速率散射濁度法(LSR)是定量測(cè)定多價(jià)肺炎球菌多糖疫苗的重要方法之一。該方法是建立在免疫反應(yīng)聚合物形成速率的基礎(chǔ)上，同時(shí)由于抗原抗體反應(yīng)的特異性，LSR法能夠區(qū)分并準(zhǔn)確測(cè)定出23價(jià)肺炎多糖疫苗中各個(gè)血清型的多糖含量。起初該方法是被廣泛用于研究蛋白抗原與它的特異性抗體的反應(yīng)[1]，用在檢測(cè)多糖抗原抗體反應(yīng)方面不多。

　　雙光徑免疫濁度分析儀(IMMAGE)由于采用了近紅外波長(zhǎng)檢測(cè)手段和顆粒包被技術(shù)使其檢測(cè)精密度大大提高。并且IMMAGE的用戶自定義試劑(UDR)系統(tǒng)方便了用戶建立自定義檢測(cè)項(xiàng)目，用戶可以根據(jù)實(shí)際工作需要自行編輯反應(yīng)參數(shù)，如樣品、試劑的用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)類型等。在用戶對(duì)自定義項(xiàng)目定標(biāo)完成后，該系統(tǒng)可以根據(jù)用戶的選擇自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線,顯示相關(guān)參數(shù)，用戶可以節(jié)約自己換算的時(shí)間。并且，電腦會(huì)自動(dòng)存儲(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)，在檢測(cè)樣品時(shí)自動(dòng)計(jì)算結(jié)果。IMMAGE采用封閉式自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，其加樣、稀釋、反應(yīng)、洗滌和分析等快速全自動(dòng)化，在15min內(nèi)可獲得測(cè)定結(jié)果，可作為多價(jià)肺炎多糖疫苗定量測(cè)定手段。本文結(jié)果表明，IMMAGE測(cè)定8型肺炎球菌多糖具有較好的精密度、重復(fù)性，CV均小于5%，測(cè)定樣品時(shí)有較好的回收率，回收率為(99.25±0.02)%。分析靈敏度為0.2 μg/mL。此法有較好的稀釋線性，平均回收率為99.82%。標(biāo)準(zhǔn)曲線至少可以穩(wěn)定5 d。加入19F、5、17F、33F、10A五個(gè)型別的肺炎球菌多糖(含量<100 μg/mL)對(duì)檢測(cè)無顯著性干擾。初步的研究結(jié)果證明，采用IMMAGE定量測(cè)定23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗樣品中8型肺炎多糖含量是準(zhǔn)確、可靠的，有較高的靈敏度和精密度，并且快捷、高效。

　　4參考文獻(xiàn)

　　[1]Chi-Jen lee. The Quantitatative Immunochemical Determination of Pneumococca Capsular Polysaccharide by Light scatlering Quantitative Rate Nephelornetry of Biol[J]. Stand,1983，11:55-64.

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